Restrikční enzymy jsou enzymy, které odštěpují jednovláknovou i dvojvláknovou DNA. Každý restrikční enzym má specifickou nukleotidovou sekvenci nazývanou restrikční místo, které rozpoznává a řeže. Restrikční enzymy se používají pro sekvenování DNA, mutační analýzu a klonování a amplifikaci DNA. Vědci používají restrikční enzymy k vložení genů zájmu do expresních vektorů, molekul DNA, které se mohou replikovat odděleně od chromozomální DNA. Vektor obsahující požadovaný gen může být potom zaveden do bakteriálního kmene pro expresi a charakterizaci proteinů.
Video dne
Krok 1
Identifikujte stránky restrikčních enzymů ve vektoru, když se podíváte na restrikční mapu. Restrikční mapa vám řekne, které enzymy budou snížit váš vektor a kde.
Krok 2
Zvolte restrikční enzym, který má také místo přítomné na vložce genu, a podívejte se na sekvenci vložky. Ujistěte se, že místo restrikce je na pozici na vaší vložce, která je mimo požadovaný gen, takže neztratíte žádnou část genu.
Krok 3
Ujistěte se, že neexistují žádné duplikáty restrikčního místa kdekoli ve vaší genové vložce nebo ve vektoru. To způsobí několikanásobné škrty ve vaší DNA a poskytne vám zavádějící data.
Krok 4
Zkuste si vybrat restrikční enzymy, které se řeže lepivými konci, spíše než tupými konci. Lepké konce se vyskytují, když enzym stříhá dvojvláknovou DNA postupným způsobem, přičemž zůstává jednovláknový přesah, který usnadňuje připevnění s řezaným REPLACEem opačným způsobem. Tupé konce se vyskytují, když je dvouvláknová DNA řezána hladkým způsobem a tyto jsou obtížněji připojitelné.
Krok 5
Zvolte jiný restrikční enzym pro oba konce vaší vložky, abyste se ujistili, že je vložen do vektoru ve správné orientaci a zajistí, aby se vektor znovu nepřipojil k sobě.
Krok 6
Pokuste se vybrat dva restrikční enzymy, které fungují dobře ve stejném vyrovnávacím systému a teplotě. Pokud to není možné, spusťte každé štěpení zvlášť.
Věci, které budete potřebovat
- Sekvence vložení genu
- Restrikční mapa pro vektor výběru
- Seznam restrikčních enzymů a jejich místa pro krájení
Tipy
- restrikčních míst na DNA sekvenci rychle. Jeden takový program pochází z New England BioLabs.
